盡管使用手持式移液管處理微升級(jí)液體是一項(xiàng)常規(guī)任務(wù)，但由于表面張力、粘附力和蒸發(fā)效應(yīng)等技術(shù)難題，移液納升級(jí)體積具有挑戰(zhàn)性。Cellsorter開(kāi)發(fā)了一種全自動(dòng)壓電微移液管，精度<1納升，將基于成像的單細(xì)胞分離效率提高到90%以上。這一改進(jìn)在分離稀有或珍貴細(xì)胞時(shí)至關(guān)重要，尤其是在醫(yī)療應(yīng)用中。緊湊的壓電微移液管可以集成到各種（生物）化學(xué)工作流程中。它消除了塑料管、閥門(mén)、注射器和壓力罐對(duì)于樣品的高質(zhì)量相襯照明，例如細(xì)胞或微小液滴.Cellsorter構(gòu)建了與微移液管同心排列的LED環(huán)。同樣的裝置可以在顯微鏡上使用熒光或透明照明，方便地用于試劑的單細(xì)胞打印和納升級(jí)液滴打印。Cellsorter設(shè)想這項(xiàng)新技術(shù)不久將成為醫(yī)學(xué)診斷中單細(xì)胞操作的標(biāo)準(zhǔn)工具，例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離。

在實(shí)驗(yàn)室中，毫升（ml）或微升（μl）刻度的液體處理是一項(xiàng)常規(guī)任務(wù)，例如，使用手持移液管。然而，0.1μl以下的處理量是一個(gè)挑戰(zhàn)。如果液滴的尺寸小于毛細(xì)管長(zhǎng)度，則微小液滴的動(dòng)力學(xué)主要取決于重力作用下的表面張力。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)溫度和壓力下的水和空氣界面，毛細(xì)管長(zhǎng)度約為2 mm。小液滴與移液管固體表面之間的粘附力在該長(zhǎng)度范圍內(nèi)也至關(guān)重要。小水滴的快速蒸發(fā)是另一個(gè)困難。在流體系統(tǒng)中，密封將流體保持在管道或通道內(nèi)。在大多數(shù)情況下，密封件由軟彈性材料制成：各種橡膠或PTFE。由于流體部分被彈性材料包圍，因此在微觀尺度上控制其體積很麻煩。然而，當(dāng)試劑的體積受到限制時(shí)，例如在單細(xì)胞測(cè)量中，納升（nl）或皮升（pl）級(jí)液體處理是一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)。

微流控芯片處理微小體積流體的簡(jiǎn)單解決方案是使用具有微米大小通道的微流控芯片來(lái)傳導(dǎo)水溶液。將微流體集成到復(fù)雜芯片中是非常有前景的，其主要目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)芯片上實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)?；谝旱蔚奈⒘黧w（Guo等人2012；K?ster等人2008；Agresti等人2010；Brouzes等人2009；Leung等人2012）處理懸浮在石油環(huán)境中的亞納米級(jí)水滴。然而，目前可用的微流體存在許多技術(shù)缺陷（Leung等人，2012年）。這些芯片對(duì)介質(zhì)的固體污染非常敏感。需要使用含有適當(dāng)表面活性劑的特殊且昂貴的油來(lái)維持穩(wěn)定的乳液。在大多數(shù)情況下，實(shí)現(xiàn)流量的適當(dāng)穩(wěn)定性是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，更不用說(shuō)在試驗(yàn)前和試驗(yàn)后的瞬態(tài)效應(yīng)了, 液滴內(nèi)捕獲的單個(gè)細(xì)胞可以單獨(dú)進(jìn)行DNA條形碼編碼、匯集和隨后測(cè)序（Lee等人，2016年）。然而，在這個(gè)過(guò)程中，單個(gè)細(xì)胞的表型信息丟失了。因此，DNA/RNA序列不能與腫瘤或發(fā)育組織中特定細(xì)胞的作用相關(guān)。

壓電液滴系統(tǒng)可以通過(guò)微移液管注入nl或pl大小的液滴(www/scienion/com/; www/cytena/com）。注射器中的壓電致動(dòng)器產(chǎn)生壓力波，從毛細(xì)管中注入液滴。注射器不能像手持式移液管一樣在同一周期內(nèi)抽取和沉積小體積的液體。此解決方案僅在空氣中有效。壓電注射器機(jī)器人可用于打印，但不能用于流體的pl–nl 級(jí)采樣。

使用玻璃微移液管的微注射器和FluidFM微注射/精確到飛秒級(jí)是細(xì)胞生物學(xué)中一項(xiàng)眾/所/周/知的技術(shù)（Takagi et al.2007）。也可以使用微流控原子力顯微鏡（FluidFM）進(jìn)行微注射（Meister等人，2009年）。但是，微型噴射器不能以高精度拉動(dòng)和噴射相同的流體。由于長(zhǎng)，宏觀彈性管和密封，當(dāng)他們拔出液體后開(kāi)始注射時(shí),這些設(shè)備工作時(shí)有很大的滯后.

SODA機(jī)器人——機(jī)器人（Zhu等人，2013年）使用由注射泵控制的1μl Hamilton注射器，并連接到帶有1厘米泰貢管的玻璃微量移液管，從而將拉注過(guò)程的誤差降至更低。然而，這種zui/先/進(jìn)的設(shè)置很難常規(guī)應(yīng)用。即使在這個(gè)專(zhuān)門(mén)的系統(tǒng)中，拉和沉積循環(huán)也只能實(shí)現(xiàn)納升精度。SODA機(jī)器人的熱體積波動(dòng)也很明顯。SODA機(jī)器人的另一個(gè)缺點(diǎn)是漢密爾頓注射器和毛細(xì)管之間固有的1厘米短管，導(dǎo)致難以操作的設(shè)置。該裝置的速度受注射泵的速度限制。SODA機(jī)器人的最終精度也受到漢密爾頓注射器和注射泵的限制。

根據(jù)顯微圖像使用微量移液管拾取細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離是一種成熟的方法（Kurimoto等人，2006年；Hosokawa等人，2009年）。為了提高通量和效率，在過(guò)去幾年中出現(xiàn)了應(yīng)用電動(dòng)顯微鏡和微操作器的半自動(dòng)化技術(shù)（Schneider等人，2008年；Yoshimoto等人，2013年；K?rnyei等人，2013年）。商用微移液管法的液體處理精度受到將微移液管連接至真空罐的長(zhǎng)（~1 m）塑料管的限制（K?rnyei等人，2013年；Salánki等人，2014a；Ungai Salánki等人，2016年）。管的彈性導(dǎo)致納升級(jí)流體流動(dòng)的滯后。微移液管中的流量不僅受壓力罐中的真空或超壓的影響，還受管的彈性膨脹的影響。盡管這一限制可以在研究實(shí)驗(yàn)室處理，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞RNA測(cè)序（Kozlov等人2017；Ngara等人2018）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）分離（Winter等人2018）的結(jié)果，蛋白質(zhì)工程（Piatkevich et al.2018）或單細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)（Salánki et al.2014b；Sándor et al.2016；Ungai Salánki et al.2019）,妨礙了它們?cè)卺t(yī)學(xué)診斷中的常規(guī)應(yīng)用。

盡管如此，閥控射流系統(tǒng)的簡(jiǎn)單性和靈活性仍有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，包括其應(yīng)用恒定、穩(wěn)定和高真空的能力，以及由此產(chǎn)生的高流體動(dòng)力。如果需要，可將微移液管收集的液體體積設(shè)置為高（幾微升）。這在分離強(qiáng)粘附細(xì)胞或測(cè)量細(xì)胞粘附力時(shí)非常有用。當(dāng)前開(kāi)發(fā)的背景是閥控細(xì)胞分選儀(www/singlecellpicker/com/valve-control)在電動(dòng)顯微鏡上工作。真空罐和超壓罐通過(guò)兩個(gè)高速流體閥與垂直微量移液管相連。在Petri培養(yǎng)皿中掃描樣本并用計(jì)算機(jī)視覺(jué)或手動(dòng)檢測(cè)細(xì)胞后，微移液管通過(guò)打開(kāi)微移液管和真空罐之間的閥門(mén)逐個(gè)拾取所選細(xì)胞。然后，通過(guò)打開(kāi)超壓罐和微量移液管之間的閥門(mén)，將單個(gè)細(xì)胞沉積到PCR管中（K?rnyei等人2013；Salánki等人2014a）。

在目前的工作中，Cellsorter優(yōu)化并應(yīng)用了基于微移液管的裝置，以最小化其拾取體積并最大限度地提高其精度。Cellsorter開(kāi)發(fā)了一種全自動(dòng)、緊湊的壓電微移液管，結(jié)合高分辨率成像和<1nl液體處理精度（CellSorter Kft（2019）壓電微移液管PCT專(zhuān)/利申請(qǐng)HU 2019/000002）(www/singlecellpicker/com/piezo-head）。它消除了塑料管、閥門(mén)、注射器和壓力罐的影響。它可以分離敏感或稀有細(xì)胞或效率>90%的細(xì)胞?？捎糜趎l級(jí)液滴打印，包括單細(xì)胞打印

打開(kāi)壓電吸管并將壓電頭固定在顯微鏡（蔡司）上后，校準(zhǔn)壓電致動(dòng)器，cellsorter測(cè)量了壓電致動(dòng)器（PI Ceramic P-885.11）自由端的位移，作為電壓的函數(shù)，從0 V開(kāi)始到+100 V，然后從+100 V回到0 V。相鄰測(cè)量點(diǎn)之間的電壓階躍以50ms線性斜坡施加。Cellsorter在每個(gè)施加電壓步驟后捕獲致動(dòng)器的圖像，并將所有圖像與在0 V電壓下捕獲的第一張圖像進(jìn)行比較，以計(jì)算位移。Cellsorter用線性曲線擬合完整數(shù)據(jù)：y=0.0727±0.0055[μm/V]x+0.9502μm；R2=0.9008。產(chǎn)生的7.3μm/100 V在供應(yīng)商（PI Ceramic）規(guī)定的范圍內(nèi)

校準(zhǔn)壓電微移液管以量化壓電微移液管的液體處理精度，首先，Cellsorter在疏水35 mm皮氏培養(yǎng)皿（Greiner）中在2 ml礦物油中生成水滴。對(duì)于±50 V（100ms線性斜坡）的較大電壓，使用0.5μl Hamilton注射器沉積約0.1μl水滴。為了測(cè)試±5±10 V（100ms，線性斜坡）的較低電壓，使用內(nèi)徑（內(nèi)徑）為30μm的微移液管，使用1×1 mm2 NBR 70 O形環(huán)和+100 V制備約20 nl水滴。產(chǎn)生液滴后，微移液管靠近培養(yǎng)皿表面，距離液滴內(nèi)部100μm。Cellsorter用10倍或20倍的物鏡測(cè)定水滴體積的變化。Cellsorter將顯微鏡聚焦在液滴底部，并測(cè)量液滴與培養(yǎng)皿之間界面的d1直徑，即液滴中缺失的球形帽的直徑。Cellsorter拍攝了液滴的圖像，并在其輪廓上畫(huà)了一個(gè)圓圈。Cellsorter還測(cè)量了球形液滴的D1直徑（圖1c）。然后Cellsorter施加正或負(fù)電壓階躍。測(cè)量至少重復(fù)三次。Cellsorter再次測(cè)量了液滴底部的d2直徑和球形液滴的d2直徑。Cellsorter根據(jù)d1、d1、d2和d2計(jì)算液滴體積，如下所示：

Vdroplet = Vsphere ? Vspherical cap, where (1)

Vspherical cap = hspherical cap ?π/6(3r2 + h2spherical cap), where(2)

h spherical cap = R1,2 ?√(R21,2?r21,2), where(3)

R 1,2 =D1,2/2, (4)

r1,2 =d1,2/2 (5)

Cellsorter用線性函數(shù)擬合測(cè)量數(shù)據(jù)。作為施加電壓階躍ΔU（V）函數(shù)的液滴ΔV（nl）體積變化如下：ΔV=0.21*ΔU? 0.1329; 斜率：0.21±0.08 nl/V，R2=0.9929。

使用內(nèi)徑為30–70μm的微移液管，使用3.5×1.1 mm2 FPM O形環(huán)（超級(jí)密封），通過(guò)在礦物油或氟化油下在35 mm親水塑料培養(yǎng)皿（Greiner）中施加40–100 V（100 ms，線性斜坡）的電壓階躍，沉積油水珠下的納升液滴打印。這些液滴被認(rèn)為是球形帽。為了計(jì)算親水表面上水滴的體積，Cellsorter測(cè)量了幾個(gè)代表性水滴的接觸角（θ）：

sin θ= 2hr/(r2 + h2)    (6)

液滴高度（h）與表面上液滴直徑（2r）之比為0.49±0.05，因此θ=82°±5°。然后，Cellsorter只測(cè)量了液滴的（2r）直徑，并計(jì)算了它們的體積，如下所示：

V =πh (3r2 + h2) /6  (7)

where h = 0.98 ? r.

Cellsorter還根據(jù)壓電致動(dòng)器的校準(zhǔn)位移和O型環(huán)的尺寸計(jì)算了移液管的完整（理論）體積Vfull（nl），如下所示：

V  full = 0.0727 ? ΔU ? (RO-ring + rO-ring)2 ?π,(8)

式中，RO環(huán)為O型環(huán)內(nèi)徑的一半，rO環(huán)為O型環(huán)高度的一半

測(cè)量壓電微移液管中的流體流量波動(dòng)Cellsorter使用1×1 mm2 NBR 70 O形環(huán)測(cè)量了內(nèi)徑為30μm的微移液管中的流體流量波動(dòng)。壓電頭包括致動(dòng)器和微量移液管，通過(guò)磁性支架水平固定在配備5×物鏡的顯微鏡上。在內(nèi)徑為1.2mm的玻璃管中填充2μm熒光紅色顆粒（Spherotech）懸浮液，該懸浮液在0.1%Triton-X-100中稀釋至200倍。玻璃管的兩端用一滴礦物油封閉，以防止水懸浮液蒸發(fā)。微量移液管進(jìn)入試管，直到它到達(dá)珠子懸浮液。Cellsorter每隔30秒記錄一次珠子的運(yùn)動(dòng)。Cellsorter在這些間隔內(nèi)對(duì)壓電致動(dòng)器施加正負(fù)電壓階躍，并在顯微鏡上觀察其效果。

粒子跟蹤測(cè)速儀（PTV）和流量計(jì)算Cellsorter使用PTV來(lái)計(jì)算由電壓階躍觸發(fā)或由無(wú)電壓階躍的波動(dòng)驅(qū)動(dòng)的玻璃微移液管中的流量。在每段視頻中，Cellsorter可以跟蹤約20顆珠子。Cellsorter使用免費(fèi)的視頻到JPG轉(zhuǎn)換器將視頻中的幀提取到JPG文件中。Cellsorter使用了TrackMate ImageJ插件(www/imagej/net/Getting_started_with_Track Mate），以分析珠子的軌跡。為了檢測(cè)圖像中的珠子，Cellsorter使用了高斯差分法（DoG檢測(cè)器），這是一種可用于斑點(diǎn)檢測(cè)和跟蹤的特征增強(qiáng)算法。DoG是一種帶通濾波器，用于去除代表噪聲的高頻分量和代表圖像中較大均勻區(qū)域的一些低頻分量。在第一幀中正確檢測(cè)到珠子后，Cellsorter使用簡(jiǎn)單線性分配問(wèn)題（LAP）跟蹤器粒子鏈接算法。Cellsorter將珠子軌跡保存在xml文件中，以便使用MATLAB代碼對(duì)其進(jìn)行分析，以計(jì)算下面描述的數(shù)量。柱面坐標(biāo)系固定在微量移液管的軸上，從微量移液管尖/端測(cè)量軸向坐標(biāo)X，徑向坐標(biāo)R（圖2a）。珠子的徑向位移可以忽略不計(jì)。Cellsorter計(jì)算了軸向位移（圖2d）：

圖1壓電微量移液管。帶有彈性管和注射器的標(biāo)準(zhǔn)微量移液管。壓電微移液管的示意圖。頂部的壓電致動(dòng)器被推到尺寸在[1–6]×1 mm范圍內(nèi)的O形圈上。玻璃微移液管通過(guò)垂直通道連接到O形圈的內(nèi)部體積。這些都裝滿了水。相位對(duì)比度照明由與微移液管同心排列的一圈LED提供。c校準(zhǔn)原理。當(dāng)使用1×1 mm2 O形環(huán)向壓電元件施加電壓時(shí)，Cellsorter測(cè)量了先前沉積在油下疏水表面上的水滴體積的變化。根據(jù)電壓階躍前后的液滴直徑（D1，D2）和接觸面積直徑（D1，D2），Cellsorter計(jì)算了作為施加電壓函數(shù)的體積變化（補(bǔ)充圖3）。結(jié)果，Cellsorter獲得了斜率為0.21±0.08 nl/V（d）的校準(zhǔn)曲線。e–g納升液滴打印。e使用內(nèi)徑為70μm的移液管（3.5×1.1 mm2 O形圈）在礦物油下打印+75 V（100 ms，線性斜坡）的水滴。根據(jù)[0]中壓電致動(dòng)器f的位移→ 100 V]（矩形）和[100→ 在0 V（圓形）范圍內(nèi)，Cellsorter計(jì)算了帶有3.5×1.1 mm2 O形環(huán)的移液管的完整體積變化。壓電位移的滯后在0→ + 100→ 0伏航向。打印液滴g的體積非常均勻（補(bǔ)充圖4）。由于水和油之間的表面張力，它低于計(jì)算的移液全體積，并且取決于微移液管的直徑（30、50、70μm）。當(dāng)從微移液管中推出液滴時(shí)，由于表面張力，水和油界面處的拉普拉斯壓力與微移液管的直徑成反比。對(duì)于I.D.30、50和70μm微量移液管，Cellsorter能夠成功應(yīng)用于打印液滴的最小電壓分別為80、50和40 V（Cellsorter沒(méi)有在80 V下使用I.D.50和70μm微量移液管）

Δx(t) = x(t) ? x(t ?Δt),(9)

平行于微量移液管軸線的珠子。Cellsorter計(jì)算了珠子的軸向速度：

v(t) =Δx(t)/Δt  (10)

圖2壓電微移液管中的流量波動(dòng)。從側(cè)面看微移液管的幾何形狀。Cellsorter測(cè)量了內(nèi)徑為30μm的微量移液管的錐角（α=6.3°）及其孔徑半徑（R0）。圓柱坐標(biāo)系固定在微移液管的軸上，從微移液管尖/端測(cè)量軸向坐標(biāo)X和徑向坐標(biāo)R。微移液管的壁在b中用白色虛線表示。Cellsorter將微移液管放入另一個(gè)直徑為D=1.2 mm的玻璃管中。這個(gè)外管充滿了水，其中含有2μm的熒光珠，在圖像左側(cè)顯示為白點(diǎn)。外管內(nèi)的水相兩端被一滴油堵塞，以避免蒸發(fā)。紅色虛線表示左側(cè)的水和右側(cè)的油之間的界面。當(dāng)微移液管從右側(cè)向內(nèi)推入外管并到達(dá)水相時(shí)，微珠進(jìn)入微移液管。Cellsorter跟蹤并分析了移液管（c）中微珠的運(yùn)動(dòng)。d微移液管中六個(gè)選定微珠的位移隨時(shí)間的變化。在5分鐘時(shí)施加+6 V的電壓階躍。Cellsorter根據(jù)微珠位移和微移液管的幾何形狀計(jì)算流速e。從微量移液管流出的流體的計(jì)算體積如f所示（見(jiàn)補(bǔ)充視頻1，2）

由于微珠的密度較低，Cellsorter無(wú)法在移液管中*采樣拋物線速度分布。因此，Cellsorter使用以下公式計(jì)算基于最快胎圈的估計(jì)流量（圖2e）：

Q(t) = v(t) ? A(x) (11)

式中，A（x）是特定珠粒位置處微量移液管的橫截面（圖2a）：

A(x) = R pipette(x)2 ?π, (12)

R pipette = (x + x0) tgα/2, (13)

x0 =R0/tgα/2  (14)

最后，Cellsorter計(jì)算流量V作為流量Q的時(shí)間積分（圖2f）：

ΔV(Δt) =0Δt Q(t)dt. (15)

3T3細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ATCC；CCL-92）在補(bǔ)充有10%FCS（Sigma）的MEM中按照ATCC細(xì)胞生物學(xué)收集指南生長(zhǎng)。用親脂性熒光染料DiI（10μM，37℃下30分鐘，體外培養(yǎng)）對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行染色。在分選之前，3T3細(xì)胞在37℃下用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液（Gibco，25300）處理6分鐘；然后，將細(xì)胞懸浮液以300 g離心2分鐘（Ungai Salánki等人，2016）。

Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)ATCC細(xì)胞生物學(xué)收集指南，永生化人類(lèi)T淋巴細(xì)胞系（ATCC；TIB-152）在補(bǔ)充有10%FCS（Sigma）的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。用親脂性熒光染料DiI（100μM，37℃下15分鐘，體外培養(yǎng)）對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行染色；然后，以1500 RPM的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。

HT-29細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)ATCC細(xì)胞生物學(xué)收集指南，將HT-29大腸腺癌細(xì)胞系（ATCC；HTB-38）培養(yǎng)在補(bǔ)充有10%FCS的McCoy 5A培養(yǎng)基中。在分選之前，用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液（Gibco，25300）在37℃下處理HT-29細(xì)胞5分鐘；然后，以900 RPM的轉(zhuǎn)速離心細(xì)胞懸浮液5分鐘。

3D打印微孔到皮氏培養(yǎng)皿Cellsorter將高度為1 mm的微型多孔板打印到塑料皮氏培養(yǎng)皿（Greiner）中。Cellsorter使用定制改進(jìn)的商用3D打印機(jī)（Ultimaker）在35 mm皮氏培養(yǎng)皿中打印四個(gè)5×5 mm2正方形的4孔板（Ungai Salánki等人，2016）。

PDMS微孔Cellsorter用聚二甲基硅氧烷（PDMS，Dow Corning Sylgard 184）制備了四個(gè)5×5 mm2微孔，用于模制4孔嵌件。PDMS彈性體和固化劑以10:1的比例混合，并模塑成由聚甲醛（POM）制成的模塑形式。PDMS在室溫下聚合過(guò)夜，并從模塑形式上剝離。Cellsorter將高度為1 mm的PDMS插入物放入疏水培養(yǎng)皿（Greiner）中。

在微孔中創(chuàng)建一薄層細(xì)胞懸浮液，Cellsorter用20μl細(xì)胞培養(yǎng)基覆蓋所有四個(gè)微孔，以濕潤(rùn)疏水性35 mm皮氏培養(yǎng)皿的表面。Cellsorter從孔中取出多余的培養(yǎng)基，用于從中提取細(xì)胞。Cellsorter在皮氏培養(yǎng)皿中加入2毫升礦物油（sigma）。將添加10%FCS的10-15μl培養(yǎng)基中的1500-50000個(gè)細(xì)胞注射到皮氏培養(yǎng)皿中的一個(gè)5×5 mm2微孔中。

從細(xì)胞懸浮液中自動(dòng)分離單細(xì)胞Cellsorter使用自動(dòng)微量移液管裝置（細(xì)胞分選機(jī)）（K?rnyei等人2013；Salánki等人2014a）在顯微鏡上檢測(cè)和分離單細(xì)胞。壓電致動(dòng)器（PI陶瓷）控制微移液管的體積。內(nèi)徑為30μm的微移液管被Sigmacote（Sigma-Aldrich）包覆，以避免細(xì)胞粘附在微移液管壁上。Cellsorter將微量移液管插入壓電頭，并用去離子水填充。Cellsorter用微量移液管的尖/端接觸培養(yǎng)皿的表面，以精確校準(zhǔn)其垂直位置（K?rnyei等人，2013）。Cellsorter通過(guò)捕獲覆蓋整個(gè)或部分5×5 mm2的馬賽克圖像來(lái)掃描感興趣區(qū)域。使用CellSorter軟件中實(shí)現(xiàn)的局部方差圖像分割方法，通過(guò)計(jì)算機(jī)視覺(jué)檢測(cè)熒光細(xì)胞。為了優(yōu)化細(xì)胞選擇，可以手動(dòng)調(diào)整檢測(cè)參數(shù)（包括靈敏度、細(xì)胞亮度范圍和細(xì)胞大小）。選擇要分離的細(xì)胞格后，Cellsorter運(yùn)行排序過(guò)程。在提取第一個(gè)細(xì)胞之前，將培養(yǎng)基放入微量移液管中，以避免細(xì)胞的滲透休克。為了實(shí)現(xiàn)精確的細(xì)胞定位，Cellsorter使用自適應(yīng)細(xì)胞定位校正了細(xì)胞坐標(biāo)（Ungai Salánki等人，2016）。為了拾取和沉積單個(gè)細(xì)胞，Cellsorter施加了分別為6伏（100毫秒，線性斜坡）和+30伏（2000毫秒，線性斜坡）。在將細(xì)胞沉積在比Cellsorter用于拾取的體積更大的體積中之后，Cellsorter需要將移液管重置到其初始位置（電壓）。因此，Cellsorter在無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基儲(chǔ)存庫(kù)中，通過(guò)應(yīng)用? 24伏（2000毫秒，線性斜坡）。當(dāng)拾取細(xì)胞時(shí)，尖/端位于皮氏培養(yǎng)皿表面上方30μm處，當(dāng)將細(xì)胞沉積在貯存器中時(shí)，尖/端位于皮氏培養(yǎng)皿表面上方50μm處。沉積區(qū)域選擇在4孔微孔板的第二個(gè)孔中。Cellsorter把第三口井用作水庫(kù)。單細(xì)胞分離的所有步驟均由軟件（CellSorter）*自動(dòng)控制完成。

細(xì)胞活力測(cè)定Cellsorter使用HT-29細(xì)胞量化了單細(xì)胞分離程序?qū)?xì)胞活力的影響。細(xì)胞在新的組織培養(yǎng)皮氏培養(yǎng)皿中沉積并進(jìn)一步培養(yǎng)。分離的細(xì)胞在37°C的5%CO2中培養(yǎng)2小時(shí)，然后過(guò)夜。2小時(shí)后，首先通過(guò)計(jì)數(shù)具有正常粘附形態(tài)的細(xì)胞來(lái)檢查存活率。隔夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基，并在顯微鏡上計(jì)數(shù)*鋪展的細(xì)胞。如果一個(gè)細(xì)胞在皮氏培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)分裂，它仍然只被算作一個(gè)細(xì)胞。

Cellsorter開(kāi)發(fā)了一種緊湊的壓電微移液管（圖1，補(bǔ)充圖1，2），可以輕松地自動(dòng)化并集成到各種（生物）化學(xué)工作流程中。它消除了塑料管、閥門(mén)、注射器和壓力罐的影響（K?rnyei等人，2013年；Salánki等人，2014a；Ungai Salánki等人，2016年）。 其操作類(lèi)似于滴管或手持移液管。對(duì)于樣品的高質(zhì)量相襯度（Ph1和Ph2）照明，例如細(xì)胞或微小液滴，Cellsorter構(gòu)建了與微移液管同心排列的LED環(huán)。因此，Cellsorter的方法可以*自動(dòng)化使用熒光或相襯照明活細(xì)胞。微移液管（鋒利的玻璃毛細(xì)管）連接到壓電致動(dòng)器。移液管的體積范圍由壓電致動(dòng)器和玻璃微移液管之間的O形圈設(shè)置。Cellsorter采用了各種NBR 70 O型環(huán)，包括1×1、3×1、4×1和6×1（內(nèi)徑×高度）mm2尺寸，在1-50 V工作電壓范圍內(nèi)，其近似范圍為[0.2-10]、[0.8-40]、[1.2-60]和[2.5-125]nl。壓電致動(dòng)器（圖1b）的膨脹推動(dòng)并變形O形圈，從而減小其內(nèi)部體積（補(bǔ)充圖2）。它導(dǎo)致流體在微移液管中流動(dòng)，最后從微移液管流出到皮氏培養(yǎng)皿。當(dāng)壓電致動(dòng)器收縮時(shí)，微量移液管從皮氏培養(yǎng)皿中吸出液體。液體處理精度由壓電致動(dòng)器和移液管中的熱波動(dòng)決定。

Cellsorter使用一種簡(jiǎn)單的方法校準(zhǔn)壓電吸管，方法是在顯微鏡上將水注入油環(huán)境中的水珠中（圖1c，d，補(bǔ)充圖3）。Cellsorter通常可以在以下情況下達(dá)到亞納升精度：移液體積在0.5-10 nl范圍內(nèi)（表1）。

Cellsorter使用3.5×1.1 mm2的O形圈將壓電吸管用于nl液滴打印。Cellsorter在油下將水滴打印成網(wǎng)格圖案（圖1e，補(bǔ)充圖4）。液滴的橫向坐標(biāo)由軟件設(shè)定，整個(gè)打印過(guò)程無(wú)需人工干預(yù)。打印nl液滴形成的任何2D圖案都可以以類(lèi)似的方式進(jìn)行。Cellsorter測(cè)量了打印液滴的體積（圖1e，g），并將其與根據(jù)壓電致動(dòng)器的位移（圖1f）計(jì)算的移液管的完整體積變化進(jìn)行比較。壓電位移在0→ + 100→ 0伏航向。Cellsorter可以通過(guò)壓電電壓在10–60 nl范圍內(nèi)控制打印液滴的體積。打印液滴均勻，標(biāo)準(zhǔn)偏差為幾nls（圖1g）。液滴的體積低于計(jì)算得出的吸液全體積，這取決于微吸液管的直徑，因?yàn)樗陀椭g的表面張力。（將水推回移液管的拉普拉斯壓力與移液管直徑成反比。）

Cellsorter使用一個(gè)1×1 mm2的O形環(huán)，用熒光微球的粒子跟蹤測(cè)速法定量了微量移液管中流體流動(dòng)的微觀波動(dòng)。熒光微球放在玻璃管內(nèi)，末端帶有礦物油塞，以避免蒸發(fā)（圖2a，b）。Cellsorter放下微量移液管，在顯微鏡上觀察微珠的運(yùn)動(dòng)。Cellsorter記錄了珠子的運(yùn)動(dòng)（補(bǔ)充視頻1、2），并使用ImageJ TrackMate軟件插件進(jìn)行分析(www/imagej/net/Getting_start ed_with_Track Mate（圖2c）。Cellsorter在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中跟蹤觀察了約20個(gè)珠子，并計(jì)算了珠子的位移作為時(shí)間的函數(shù)（圖2d）。根據(jù)胎圈位移確定流速和流量（圖2e、f、補(bǔ)充圖5）。峰值的估計(jì)流速為373±29 pl/s，平均體積波動(dòng)率為36±6 pl/s，因此信噪比為10。

Cellsorter使用1×1 mm2 O形環(huán)將壓電吸管用于單細(xì)胞從懸浮液中分離。細(xì)胞被保存在一層薄薄的培養(yǎng)基上，上面覆蓋著油，以盡量減少液體的流動(dòng)和培養(yǎng)基的蒸發(fā)。Cellsorter采用適應(yīng)性細(xì)胞靶向（Ungai Salánki et al.2016）來(lái)利用內(nèi)徑為30μm的微移液管實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)募?xì)胞靶向（圖3a-D）。Cellsorter使用了三個(gè)獨(dú)立的孔：一個(gè)用于拾取，第二個(gè)用于沉積細(xì)胞，第三個(gè)用于重置壓電移液管。Cellsorter施加的電壓為? 6V（100ms，線性斜坡）以拾取體積為1.25±0.48nl的單個(gè)細(xì)胞。Cellsorter可以將單細(xì)胞分離的效率從以前的約75%（Ungai Salánki et al.2016）提高到90%以上，而無(wú)需移除任何相鄰細(xì)胞。3T3、Jurkat和HT-29細(xì)胞的單細(xì)胞拾取效率分別為95±1.2%（n=82）、96±5.8%（n=48）和91±0.8%（n=33）（圖3f-h）。Cellsorter以6 nl的較大體積沉積細(xì)胞，以達(dá)到100%的沉積率（圖3e）。細(xì)胞分選的空間分辨率為29±3.6μm，也就是說(shuō)，距離目標(biāo)細(xì)胞較遠(yuǎn)的細(xì)胞未被移除（圖3i，j）。

Cellsorter量化了分離的單個(gè)細(xì)胞在分離后2小時(shí)和1天的存活率。分離2小時(shí)后，93±3%的研究（n=30）細(xì)胞存活。隔夜培養(yǎng)后，83±9%的分離細(xì)胞存活。

表1壓電微移液管的校準(zhǔn)

Cellsorter通過(guò)在顯微鏡上將水注入（或從）先前沉積在礦物油下的水滴（或從中拉出）作為施加電壓的函數(shù)來(lái)校準(zhǔn)壓電微移液管。當(dāng)正電壓步驟導(dǎo)致注射時(shí)，負(fù)電壓步驟將水拉入微量移液管（圖1c，d）。Cellsorter通過(guò)測(cè)量施加電壓前后液滴的直徑和接觸面積的直徑來(lái)計(jì)算液滴體積的變化（補(bǔ)充圖3）。Cellsorter使用了一個(gè)1×1mm2的O形圈

圖3單細(xì)胞分離。單細(xì)胞分離前（a）和后（b）的小鼠成纖維細(xì)胞。c、 d放大a、b中虛線框定的區(qū)域。I.d.30μm微移液管的尖/端顯示在a的角/落。/選擇分離的標(biāo)記單元格中的黃色框。紅框中彼此太近的細(xì)胞被軟件排除在外，以避免拾取多個(gè)細(xì)胞。相同位置的框架如b所示。圖像比較表明，即使由于培養(yǎng)皿中的流體對(duì)流，細(xì)胞從初始位置移位，目標(biāo)細(xì)胞也可以很容易地分離出來(lái)，而不必拾取紅色框架中的細(xì)胞。整個(gè)隔離過(guò)程可以被跟蹤并保存在實(shí)時(shí)取景攝像機(jī)圖像中，用于回顧和記錄實(shí)驗(yàn)。在e中，選擇24個(gè)單個(gè)Jurkat細(xì)胞分離成網(wǎng)格模式，細(xì)胞之間的距離為500μm。由于拾取#12和#23單元格失敗，網(wǎng)格的相應(yīng)位置為空。在Cellsorter測(cè)試的所有細(xì)胞類(lèi)型中，單細(xì)胞分離f–h的效率都在90%以上。i在微孔中混合50個(gè)熒光細(xì)胞和50000個(gè)未標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域的紅色熒光和相位對(duì)比度圖像的組合圖片。用顯微移液管（如圖角所示）采集熒光細(xì)胞。四個(gè)相鄰的細(xì)胞也被移除，如拾取后拍攝的圖像j所示。通過(guò)測(cè)量靶細(xì)胞中心與最遠(yuǎn)移除細(xì)胞中心之間的距離，Cellsorter計(jì)算了分選的空間分辨率（R）：R=29±4μm

Cellsorter開(kāi)發(fā)并校準(zhǔn)了用于納升范圍內(nèi)液體處理的壓電微移液管。移液管的工作原理和幾何形狀非常簡(jiǎn)單。它包含一個(gè)由壓電致動(dòng)器變形的彈性O(shè)形圈（CellSorter Kft（2019）壓電微移液管PCT專(zhuān)/利申請(qǐng)HU 2019/000002）。移液管的體積范圍由O形環(huán)的直徑設(shè)置；因此，通過(guò)更換O型環(huán)，相同的裝置可以應(yīng)用于不同的體積范圍。對(duì)微移液管的校準(zhǔn)證明，通過(guò)應(yīng)用~[5–50]V，該裝置可以在[1–10]nl范圍內(nèi)可靠地使用。Cellsorter使用粒子跟蹤測(cè)速儀測(cè)量了微移液管的皮克級(jí)波動(dòng)。平均體積波動(dòng)率為36±6 pl/s，導(dǎo)致信噪比為10。

Cellsorter將該裝置應(yīng)用于油下納米級(jí)水珠打印。Cellsorter可以通過(guò)壓電電壓在[10–60]nl范圍內(nèi)控制打印液滴的體積。打印液滴均勻，標(biāo)準(zhǔn)偏差為幾nls。Cellsorter還將該裝置用于單細(xì)胞分離。它將基于成像的單細(xì)胞分離效率從以前的75%提高到90%以上。這一改進(jìn)在分離稀有或珍貴細(xì)胞時(shí)至關(guān)重要，尤其是在醫(yī)療應(yīng)用中。為了獲得高質(zhì)量的相位對(duì)比成像，Cellsorter構(gòu)建了與微移液管同心排列的LED環(huán)。微移液管可以在顯微鏡上使用熒光或透明照明進(jìn)行全自動(dòng)操作。Cellsorter設(shè)想這項(xiàng)新技術(shù)不久將成為醫(yī)學(xué)診斷中單細(xì)胞操作的標(biāo)準(zhǔn)工具，例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離。

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